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Dominique Belin
Professor
Departamento de Patologia e Imunologia Universidade de Genebra Medical Schoolylabus – O que você aprenderá com este curso
Sessão 1
No início da genética, no trabalho de Mendel e Morgan, houve um vazio completo entre os genes e os personagens que eles determinam. Durante a primeira semana, discutiremos a relação entre genes e enzimas. Começaremos com a descrição de Alkaptonuria por Garrod, em 1902, que ele chamou alguns anos depois de um erro inato do metabolismo. Este foi o primeiro exemplo documentado de uma característica recessiva humana, a primeira associação de uma condição humana com os princípios de Mendel e o primeiro vínculo entre um gene e uma enzima. Este trabalho e o de Cuénot na cor de pêlo de ratos foram essencialmente esquecidos na comunidade de biologia nas décadas seguintes. Depois de trabalhar com grande dificuldade na cascata enzimática que leva à formação do olho pigmentado de moscas de frutas, miçangas e tatum fundados no campo da genética bioquímica, isolando mutantes condicionais que afetam a síntese de vitaminas e aminoácidos. Isso foi feito pela primeira vez com um molde e depois estendido a bactérias. Essas experiências levam à hipótese de “um gene, uma enzima”. Embora a hipótese agora seja comprovada em muitos casos, as exceções, incluindo enzimas multigéneas, RNAs estruturais e enzimáticos expandiram o conceito em vez de invalidar -o.
Sessão 2
A maioria das pessoas acreditava que os genes devem ser feitos de proteínas porque os ácidos nucleicos eram considerados simples demais para transportar informações genéticas. Avery trabalhou a vida toda em pneumococcus e pneumonia bacteriana. Griffith mostrou que a transformação de uma cepa não virulenta pode ser alcançada em camundongos por moeda de bactérias virulentas mortas pelo calor. O laboratório de Avery conseguiu obter transformação no tubo de ensaio, mas levou muitos anos para estabelecer um ensaio confiável e, finalmente, purificar a molécula responsável por esse efeito, que acabou sendo o DNA.
Sessão 3
Embora esse trabalho fosse bem conhecido, a maioria dos cientistas não estava convencida da implicação geral desse fenômeno. Além disso, muitos bioquímicos acreditavam que mesmo o DNA purificado estava contaminado com uma proteína. Finalmente, a transformação foi um processo muito ineficiente e o mecanismo de transformação permaneceu misterioso por muitos anos.
O trabalho de Hershey e Chase finalmente convenceu a comunidade científica de que os genes são feitos de DNA.
Agora percebemos que a troca de DNA por transformação é muito comum e participa da transferência horizontal de DNA entre pelo menos espécies bacterianas e foi um acelerador considerável da evolução
Sessão 4
A origem das mutações foi um campo de pesadas discussões entre os proponentes do darwinismo e os do lamarckismo. A principal questão era definir uma abordagem experimental que discriminaria inequivocamente entre mutações que ocorrem aleatoriamente e mutações causadas pelo agente seletivo usado para revelar sua existência. No caso de bactérias que se tornaram resistentes à ação lítica de um bacteriófago, as hipóteses foram rotuladas como “mutação para imunidade” versus “imunidade adquirida”. Luria e Delbrück perceberam que as variações observadas no número de bactérias resistentes em diferentes culturas paralelas estavam intimamente ligadas à hipótese da mutação. Essa colaboração excepcional entre um físico teórico e um bacteriologista é um exemplo perfeito de trabalho interdisciplinar, enquanto esses dois “estrangeiros inimigos” estavam trabalhando nos EUA.
Sessão 5
Naquela época, nem estava claro que as bactérias tinham genes e a maioria dos trabalhos de bacteriologia era apenas descritiva. O uso de uma abordagem quantitativa permitiu aos autores resolver a questão. O teste de flutuação é uma ferramenta muito poderosa para calcular as taxas de mutação.
Logo depois, Newcombe fez um experimento simples, mas elegante, para demonstrar que o aumento do número de bactérias resistentes detectadas após a expansão clonal reflete tanto a amplificação de mutantes preexistentes quanto a ocorrência contínua de novas mutações.
Sessão 6
Quando o DNA foi considerado o material genético, não se sabia como essa molécula poderia carregar informações. A estrutura do DNA tornou -se assim de importância crítica. As imagens de raios X disponíveis obtidas por M. Wilkins e R. Franklin só produziram uma imagem aproximada, e até R. Franklin, que tinha os dados de difração mais claros, não conseguiram decidir se as moléculas continham duas ou três fios. Pauling e Watson e Crick usaram modelos moleculares com distâncias inter-nucleares conhecidas (comprimento da ligação) e ângulos de ligação para prever uma estrutura. Enquanto o modelo de Pauling não era realista, pois usava a forma protonada do fosfato, o modelo proposto por Watson e Crick propôs que o DNA consiste em um par de fios de DNA. Além disso, indicou que qualquer sequência de nucleotídeos poderia ser acomodada na estrutura. A única questão biológica central abordada no primeiro artigo foi a replicação, e a frase famosa não passava da reivindicação prioritária. Muito mais biologia foi discutida no segundo artigo. Supunha -se que o emparelhamento de bases seja suficiente para explicar a fidelidade da replicação. A importância da polimerase de DNA na fidelidade de replicação foi demonstrada pela primeira vez por Speyer.
Sessão 7
Antes dos experimentos de Benzer, a maioria do mapeamento genético exigia uma triagem de toda a progênie de uma cruz para calcular as frequências de recombinação. O poder do sistema RII de fago T4 reside nos fatos de que muitos mutantes independentes podem ser identificados pela pontuação da morfologia da placa na tensão do hospedeiro permissivo e que apenas os recombinantes do tipo selvagem crescerão na tensão restritiva do hospedeiro. Isso, juntamente com a recombinação muito alta do DNA T4, permite a detecção de recombinação entre mutações que afetam os nucleotídeos adjacentes. O teste de complementação do CIS-Trans mostrou que o locus RII consiste em dois genes. Usando mais de 100 mutantes de deleção, que não revertem para o tipo selvagem, Benzer demonstrou pela primeira vez que a topologia do DNA é linear. Usando essas deleções, ele conseguiu esculpir os genes RIIA e RIIB em 47 segmentos. Um teste de recombinação muito simples e rápido permitiu que ele mapeie milhares de mutantes pontuais, tanto independentes quanto induzidos por mutagênicos, em segmentos individuais. Este mapa era perfeitamente congruente com mapas laboriosamente construídos por testes clássicos de recombinação. A topografia do mapa era surpreendentemente não aleatória, com sites 100 vezes mais propensos a mudar do que outros e são chamados de pontos quentes. O espectro de locais detectados após a mutagênese foi surpreendentemente diferente. Sabe-se agora que a maioria dos mutantes espontâneos do RII é deslocada em quadros, isto é, adição ou exclusão de um ou alguns pares de bases que perturbam a tradução do mRNA em proteína. Por outro lado, a maioria das mutagênicas usadas neste trabalho induz substituições básicas que geralmente não prendem a tradução. Agora que a sequência do locus RII é conhecida, a saturação do mapa é tal que há cerca de uma mutação a cada 8 nucleotídeos.
Sessão 8
Benzer e Champe estudaram as propriedades das deleções que cobrem o limite entre Riia e Riib. Como esperado, a maioria deles não pode fornecer nenhuma função durante a infecção de uma tensão não permissiva. Uma deleção, no entanto, foi altamente incomum e ainda foi capaz de fornecer a função RIIB, mesmo que não tenha 10% dos locais do RIIB. Essa exclusão foi fundamental para confirmar a natureza geral do código genético proposto por Crick et al. Na discussão, os autores evocam a noção de enzimas bisfuncionais, como a triptofano sintase. Nas bactérias, as duas atividades catalíticas são realizadas por proteínas individuais codificadas por enzimas adjacentes. Nos eucariotos, ambas as reações são realizadas por uma única proteína: o produto da primeira reação não se difunde, mas é “canalizado” para o segundo local ativo. Esta é apenas uma exceção ao modelo de enzima One Gene One discutido na primeira sessão.
Sessão 9
Crick et al. Inicie o artigo apresentando as evidências de que o código deve não ser sobrecarregado. Uma evidência, fornecida por Brenner, é o trabalho fundador do que se tornará bioinformática. Começando com uma única mutação do Riib Frameft, agora conhecida por envolver a adição de um único par de bases que desloca o quadro de leitura do mRNA, eles isolam muitas mutações supressoras intragênicas que restauram a função RIIB. A mutação original é dada um sinal de A + e seus supressores A – sinal. Eles então isolam supressores desses supressores que são eles próprios + mutantes. Todas as combinações testadas de dois e dois – mutações não têm função RIIB. A maioria das combinações de mutações A + e A tem função RIIB; As outras combinações são propostas para gerar um códon de parada entre as duas mudanças de quadro. Finalmente, vários mutantes triplos demonstraram ter função RIIB. Eles usam a exclusão incomum que funde os dois genes RII para demonstrar que a mutação de troca de quadros localizada na parte RIIa do gene fundido abolem sua função RIIB. A interpretação mais simples é que os mutantes + têm mais um (ou um menos) par de bases e que – os mutantes têm um par de bases a menos (ou mais um). Embora a natureza geral do código seja de 3N pares de bases por aminoácido, eles acreditam que o código é um código de três e não seis letras.
Sessão 10
A existência de bobagens ou códons de parada foi sugerida pelo fenótipo mutante de certas combinações de (+-) mutantes duplos (consulte a sessão anterior). Benzer observou que certos mutantes RII podem se comportar como tipo selvagem em algumas cepas restritivas que, por exemplo, não permitem o crescimento da exclusão do RII e dos mutantes de mudança de quadro; Ele chamou esses mutantes mutantes de Rii ambivalentes e as cepas supressoras de cepas. No primeiro artigo, ele usou novamente a exclusão de que funde Riia e Riib enquanto preservava a função RIIB. As mutações revertíveis analógicas básicas na região N-terminal do RIIA foram combinadas com a exclusão. Algumas das mutações, chamadas mutações missense, não afetam a função do RIIB do gene fundido. Outros, em um contraste impressionante, abolem sua função RIIB em cepas restritivas, mas não nas cepas supressoras. Uma das principais conclusões deste trabalho é que o código genético está sob o controle genético do próprio organismo. Esse controle é alcançado pelos genes que codificam os TRNAs e as sintetases de aminoácidos do organismo.
Sessão 11
Brenner discute os resultados observados em vários sistemas bacterianos e virais que descrevem mutações sem sentido e seus supressores bacterianos. Eles propõem uma nomenclatura unificadora para mutações âmbar e ocre. Eles mostram que os supressores de âmbar suprimem apenas mutações âmbar, enquanto os supressores de ocre, que geralmente são fracos, suprimem mutações âmbar e ocre. Os resultados variáveis ​​obtidos com diferentes supressores são explicados pela natureza do aminoácido inserido por cada supressor e pelos efeitos do contexto. O principal mutagênico usado neste trabalho é a hidroxilamina, que pode modificar os resíduos C, para que sejam reconhecidos como T durante a transcrição e a replicação. Como os genes RII precisam ser expressos antes da replicação, um C modificado apenas exercerá seu efeito se estiver presente na cadeia de DNA transcrita. Usando hidroxilamina, eles mostram que nem mutantes âmbar nem ocre podem ser induzidos a reverter com hidroxilamina imediatamente ou após o ciclo de crescimento em uma tensão permissiva. Como o OCHER pode ser convertido em âmbar por tratamento com 2-aminopurina, um mutagênico analógico base, os dois códons devem ter duas bases comuns (UAX) e o terceiro difere por uma transição (UAG versus UAA). Em uma brilhante caça às mutações âmbar e ocre induzidas pela hidroxilamina, eles mostram que os dois códons devem ter um U e um A. Esses dados genéticos são combinados com estudo bioquímico de proteínas produzidas pela supressão de mutantes âmbar ou por mutagênica induzida reversão desses mutantes. Os dados se encaixam perfeitamente na decifração bioquímica do código que foi realizado por Nirenberg et al.
Sessão 12
O fago T4 foi o primeiro organismo para o qual todos os genes essenciais foram descritos. Isso foi possível através do uso de dois tipos de mutações letais condicionais que podem ocorrer em praticamente qualquer gene. As mutações âmbar apresentam o códon de parada do UAG. Dois fatores contribuem para o uso geral de mutações âmbar. Muitas cepas derivadas da cepa K-12 original carregam supressores de âmbar e sua eficiência é muito alta. Mutações sensíveis à temperatura permitem apenas o crescimento na temperatura permissiva. Eles ocorrem na maioria das proteínas que se desenrolam na temperatura restritiva e são frequentemente degradadas; Eles também ocorrem nos genes tRNA, onde desestabilizam a estrutura, impedindo o emparelhamento de bases. As células infectadas em condições não permissivas foram analisadas bioquimicamente e por microscopia eletrônica. Mutações que impedem a replicação do DNA viral impediram a síntese de componentes virais; Eles definem os genes iniciais do T4. Mutações nos genes estruturais permitem a replicação do DNA, mas impedem a aparência de um ou mais componentes de fagos. No entanto, mutações nos genes da cabeça permitem a formação de caudas e fibras e reciprocamente, os mutantes da cauda acumulam cabeças e fibras. Com os mutantes das fibras, a cabeça e a cauda montam, mas não são infecciosas. Quando as partículas são incubadas com um extrato contendo fibras, mas sem cabeças (ou sem caudas), os componentes rapidamente, espontaneamente e eficientemente remontados para produzir partículas virais infecciosas. Os extratos formam infecções mutantes podem ser classificados como doadores de cabeça ou cauda. Em todos os casos, o genótipo do vírus ativo é determinado pelas cabeças, conforme o esperado. Essas experiências foram fundamentais na definição do processo de montagem de fagos T4: três linhas de montagem independentes (cabeça, cauda e fibra) convergem para formar um vírus infeccioso. Eles também forneceram um ensaio funcional para a purificação de componentes estruturais do fago.